Rab 6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417258-ACT

RAB6A codifica la piccola GTPasi Rab6, un regolatore centrale del traffico di membrane all’interno dell’apparato di Golgi e lungo le vie di trasporto retrogrado verso il reticolo endoplasmatico. Alternando gli stati legati a GTP e GDP, Rab6 coordina l’ancoraggio delle vescicole, lo smistamento del carico e il trasporto dipendente dai microtubuli attraverso interazioni con effettori coinvolti nel mantenimento del Golgi e nella dinamica della via secretoria. L’attività di RAB6A influenza l’organizzazione degli organelli, la secrezione proteica e il traffico endosomiale, processi spesso rimodellati nel cancro e nella neurodegenerazione. Alterazioni del trasporto dipendente da Rab6 sono state inoltre collegate allo sfruttamento, da parte dei patogeni, del traffico cellulare dell’ospite e a risposte allo stress cellulare che incidono sulla proteostasi.

Rab 6A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB6A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 6A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB6A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB6A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 6A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB6A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 6A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 6A nelle cellule tumorali con espressione di RAB6A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.