Rab 4A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401828-ACT

RAB4A codifica la piccola GTPasi Rab4A, un regolatore chiave della dinamica degli endosomi precoci e del rapido riciclo del carico internalizzato verso la membrana plasmatica. Rab4A coordina la gemmazione delle vescicole, la loro motilità e l’ancoraggio tramite interazioni con effettori endosomiali, influenzando il traffico di recettori e trasportatori che modulano la trasduzione del segnale e la composizione di membrana. Attraverso il controllo del riciclo endocitico, RAB4A incide su processi quali il turnover dei recettori per i fattori di crescita, l’assorbimento di nutrienti e il rimodellamento del citoscheletro. Un traffico dipendente da Rab4A deregolato è stato studiato nel contesto della segnalazione oncogenica, della regolazione metabolica e di fenotipi neurodegenerativi, in cui un’alterata funzione endosomiale compromette l’omeostasi cellulare.

Rab 4A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB4A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 4A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB4A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB4A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 4A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB4A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 4A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 4A nelle cellule tumorali con espressione di RAB4A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.