Rab 20 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-412563-ACT

RAB20 codifica Rab20, una piccola GTPasi che regola il traffico vescicolare all’interno del sistema endocitico, coordinando eventi di trasporto di membrana che influenzano il riciclo dei recettori, la maturazione degli endosomi e la segnalazione compartimentalizzata. Alternando gli stati legati a GTP e a GDP, Rab20 contribuisce a organizzare la gemmazione delle vescicole, la loro motilità e la fusione tramite interazioni con effettori che collegano il traffico alla dinamica del citoscheletro e alla funzione degli organelli. Alterazioni dell’attività della rete delle Rab GTPasi, inclusa la disregolazione di RAB20, sono state associate in diversi contesti sperimentali a perturbazioni dell’omeostasi cellulare, come l’adattamento metabolico, la segnalazione infiammatoria e fenotipi oncogeni. Di conseguenza, RAB20 è spesso studiato in vie che collegano il trasporto intracellulare alle risposte allo stress e a stati cellulari rilevanti per la malattia.

Rab 20 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB20 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 20 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB20 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB20, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 20. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB20 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 20 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 20 nelle cellule tumorali con espressione di RAB20 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.