R-Spondin3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404472-ACT

RSPO3 codifica R-Spondin3, un potenziatore secreto della segnalazione canonica Wnt/β-catenina che amplifica l’attività della via legandosi ai recettori LGR e neutralizzando le ligasi E3 ubiquitina RNF43/ZNRF3, stabilizzando così i recettori Frizzled/LRP sulla superficie cellulare. Attraverso questo meccanismo, R-Spondin3 regola la proliferazione epiteliale, il mantenimento delle cellule staminali e il rimodellamento tissutale, influenzando programmi di sviluppo e l’omeostasi degli organi. L’attività di RSPO3 interseca la segnalazione della matrice extracellulare e dei fattori di crescita, contribuendo a modellare interazioni angiogeniche e stromali in diversi microambienti tissutali. Un’espressione deregolata di RSPO3 o un’alterata connessione della via è implicata nella biologia delle patologie guidate da Wnt, inclusi contesti di controllo aberrante del destino cellulare e reti di segnalazione associate ai tumori.

R-Spondin3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RSPO3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

R-Spondin3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RSPO3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RSPO3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di R-Spondin3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RSPO3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da R-Spondin3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via R-Spondin3 nelle cellule tumorali con espressione di RSPO3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.