Pyrin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403193-ACT

MEFV codifica la pirina, una proteina citosolica di riconoscimento dei pattern che regola la segnalazione dell’inflammasoma e l’omeostasi dell’immunità innata nelle cellule mieloidi umane. La pirina rileva perturbazioni associate a patogeni o segnali di pericolo che influenzano la segnalazione delle GTPasi Rho e la dinamica del citoscheletro, coordinando l’assemblaggio di complessi dell’inflammasoma che controllano l’attività della caspasi-1 e la successiva maturazione delle citochine della famiglia dell’IL-1. Attraverso queste vie, la pirina contribuisce a modulare la soglia infiammatoria e le risposte infiammatorie programmate, collegando la sorveglianza del citoscheletro alle reti di segnalazione di NF-κB e delle citochine. Un’attività deregolata di MEFV/pirina è associata geneticamente a fenotipi autoinfiammatori, rendendola un nodo frequentemente studiato nella ricerca sulla segnalazione infiammatoria e sulla difesa dell’ospite.

Pyrin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MEFV senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pyrin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MEFV nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MEFV, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pyrin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MEFV nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pyrin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pyrin nelle cellule tumorali con espressione di MEFV silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.