PTPκ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402287-ACT

PTPRK codifica la fosfatasi tirosinica proteica recettoriale di tipo K (PTPκ), una fosfatasi di tipo recettoriale che modula la segnalazione dipendente dalla fosforilazione a livello della membrana plasmatica e delle giunzioni cellula‑cellula. De‑fosforilando substrati coinvolti nell’adesione e nella segnalazione dei fattori di crescita, PTPκ contribuisce alla regolazione dell’integrità epiteliale, dell’inibizione da contatto e dell’organizzazione del citoscheletro. L’attività di PTPRK interseca vie legate alla dinamica delle giunzioni aderenti e agli output delle tirosin-chinasi recettoriali, influenzando i programmi di proliferazione e migrazione. Alterazioni dell’espressione o della funzione di PTPRK sono state associate a reti di segnalazione deregolate osservate in diversi contesti patologici, a supporto della sua utilità come bersaglio meccanicistico negli studi sulla segnalazione cellulare e sulla biologia delle giunzioni.

PTPκ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PTPRK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PTPκ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PTPRK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PTPRK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PTPκ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PTPRK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PTPκ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PTPκ nelle cellule tumorali con espressione di PTPRK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.