PTH-rP Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422491-ACT

Mouse Pthlh codifica la proteina correlata all’ormone paratiroideo (PTH-rP), un regolatore secreto e ad azione locale della crescita e della differenziazione cellulare che segnala principalmente attraverso PTH1R, attivando vie dipendenti da cAMP/PKA e da PLC. PTH-rP influenza lo sviluppo osseo endocondrale, l’accoppiamento osteoblasto–osteoclasta e la biologia della muscolatura liscia e della ghiandola mammaria, con ulteriori ruoli nelle interazioni epitelio–mesenchima durante l’organogenesi. Nei tessuti adulti, PTH-rP contribuisce all’omeostasi del calcio, al rimodellamento tissutale e alle risposte di meccanotrasduzione. Una deregolazione dell’espressione di Pthlh è stata associata ad alterazioni del patterning scheletrico, a un turnover osseo modificato e a segnali paracrini associati ai tumori, rilevanti per studi sul microambiente osseo.

PTH-rP Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pthlh senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PTH-rP Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pthlh nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pthlh, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PTH-rP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pthlh nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PTH-rP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PTH-rP nelle cellule tumorali con espressione di Pthlh silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.