PSMD1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405171-ACT

PSMD1 codifica una subunità non ATPasica della particella regolatoria 19S del proteasoma 26S, un macchinario centrale per la degradazione ATP-dipendente delle proteine poliubiquitinate. Contribuendo al riconoscimento dei substrati e all’assemblaggio del proteasoma, PSMD1 supporta il controllo qualità delle proteine, la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno al DNA e la segnalazione adattativa allo stress tramite le vie del sistema ubiquitina–proteasoma. Le subunità regolatorie del proteasoma influenzano il turnover di mediatori chiave di specifiche vie, inclusi componenti della segnalazione di NF-κB e di altri programmi trascrizionali, collegando l’attività di PSMD1 a stati infiammatori e proliferativi. Una funzione del proteasoma deregolata e un’alterata espressione delle sue subunità sono spesso associate a fenotipi oncogenici, stress proteotossico e difetti dell’omeostasi proteica rilevanti per la neurodegenerazione.

PSMD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PSMD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PSMD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PSMD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PSMD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PSMD1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PSMD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PSMD1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PSMD1 nelle cellule tumorali con espressione di PSMD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.