proglucagon Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416721-ACT

Il gene umano GCG codifica il proglucagone, un pro-ormone che viene processato in modo specifico per tessuto per generare il glucagone nelle cellule α pancreatiche e peptidi incretinici come GLP‑1 e GLP‑2 nelle cellule L intestinali e in alcuni neuroni selezionati. Questi peptidi coordinano l’equilibrio energetico sistemico regolando la produzione epatica di glucosio, la secrezione di insulina, i segnali dell’appetito e la crescita intestinale, collegando GCG all’omeostasi endocrina e metabolica. Gli ormoni derivati dal proglucagone segnalano principalmente attraverso vie GPCR che attivano cAMP/PKA e programmi trascrizionali dipendenti da CREB, integrando il sensing dei nutrienti con le risposte ormonali. Un’alterazione del processamento o della segnalazione del proglucagone è associata a una regolazione inefficace della glicemia e a fenotipi più ampi di malattia metabolica, rendendo GCG un nodo chiave per lo studio della biologia delle isole pancreatiche e degli assi endocrini intestino–pancreas.

proglucagon Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GCG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

proglucagon Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GCG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GCG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di proglucagon. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GCG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da proglucagon nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via proglucagon nelle cellule tumorali con espressione di GCG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.