Pre-TCRα Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422473-ACT

Il gene murino **Ptcra** codifica la catena alfa del recettore pre–T (**Pre-TCRα**), un componente essenziale del complesso pre-TCR che si associa a **TCRβ** per formare un recettore in grado di trasdurre segnali nelle fasi precoci dello sviluppo dei timociti. La segnalazione guidata da Pre-TCRα coordina la β-selezione, la sopravvivenza e la proliferazione dei timociti **DN3/DN4**, integrandosi con la segnalazione prossimale **LCK/FYN–ZAP70/SYK**, con le vie degli adattatori **LAT/SLP-76** e con i programmi a valle **MAPK** e **NF-κB**. Regolando la transizione verso gli stadi **single-positive immaturo** e **double-positive**, l’espressione di Ptcra contribuisce a plasmare la formazione del repertorio dei linfociti T e la progressione di linea. L’alterazione della segnalazione del pre-TCR è ampiamente utilizzata come modello per studiare difetti nello sviluppo timico, una differenziazione linfoide aberrante e i meccanismi che contribuiscono alla disregolazione immunitaria.

Pre-TCRα Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ptcra senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pre-TCRα Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ptcra nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ptcra, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pre-TCRα. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ptcra nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pre-TCRα nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pre-TCRα nelle cellule tumorali con espressione di Ptcra silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.