Pr-Set7 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-415759-ACT

KMT5A kodiert Pr-Set7 (SETD8), eine Lysine-Methyltransferase mit SET-Domäne, die die Monomethylierung von Histon H4 an Lys20 (H4K20me1) katalysiert – eine Chromatinmarke, die mit der replikationsgekoppelten Nukleosomenreifung und der Genomintegrität verknüpft ist. Die Aktivität von Pr-Set7 koordiniert den Zellzyklusfortschritt, die Lizenzierung der DNA-Replikation und DNA-Schadensantworten, indem sie die Chromatinkompaktion sowie die Rekrutierung von Reparaturfaktoren reguliert. Eine dysregulierte Expression oder Aktivität von KMT5A/Pr-Set7 wurde in verschiedenen Krebs-Kontexten mit veränderten epigenetischen Zuständen, Replikationsstress und proliferativen Phänotypen in Verbindung gebracht. Als Chromatinenzym an der Schnittstelle zwischen epigenetischer Kontrolle und Checkpoint-Signalgebung wird KMT5A intensiv in Bezug auf Transkriptionsregulation, Crosstalk von DNA-Reparaturwegen und Chromatindynamik untersucht.

Pr-Set7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KMT5A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pr-Set7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KMT5A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KMT5A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pr-Set7-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KMT5A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pr-Set7-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pr-Set7-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KMT5A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.