PP2A-B56-δ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403020-ACT

PPP2R5D codifica la subunità regolatoria B56δ della proteina fosfatasi 2A (PP2A), una delle principali fosfatasi serina/treonina che modella la segnalazione fosforilativa indirizzando la selettività per i substrati e la localizzazione subcellulare dell’oloenzima PP2A. PP2A-B56δ contribuisce al controllo della progressione del ciclo cellulare, della segnalazione del danno al DNA e dell’integrità del checkpoint mitotico modulando gli stati di fosforilazione di nodi chiave delle vie di segnalazione, influenzando così la proliferazione e le risposte allo stress. Attraverso la regolazione dipendente da PP2A di reti guidate da chinasi come MAPK/ERK e PI3K/AKT, PPP2R5D aiuta a mantenere l’omeostasi della segnalazione e i programmi trascrizionali legati a differenziamento e sopravvivenza. La deregolazione o la mutazione delle subunità regolatorie di PP2A, inclusa PPP2R5D, è associata ad alterazioni dei profili di fosforilazione rilevanti per la biologia del cancro e per fenotipi neuroevolutivi, supportandone l’impiego come bersaglio meccanicistico in studi focalizzati sulle vie di segnalazione.

PP2A-B56-δ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPP2R5D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PP2A-B56-δ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPP2R5D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPP2R5D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PP2A-B56-δ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPP2R5D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PP2A-B56-δ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PP2A-B56-δ nelle cellule tumorali con espressione di PPP2R5D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.