PP2A-Aβ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403081-ACT

PPP2R1B codifica la subunità di impalcatura PP2A-Aβ, un componente fondamentale dei complessi della fosfatasi proteica 2A (PP2A) che organizzano le subunità catalitiche e regolatorie per coordinare la defosforilazione di residui di serina/treonina. Modellando l’assemblaggio dell’oloenzima, PP2A-Aβ influenza le reti di trasduzione del segnale che controllano la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno del DNA e la dinamica del citoscheletro, con effetti a valle sugli stati di fosforilazione associati a MAPK, AKT e Wnt/β-catenina. Alterazioni della funzione di impalcatura di PP2A possono perturbare l’equilibrio della segnalazione fosfatasica e sono state collegate a proliferazione deregolata e instabilità genomica in contesti rilevanti per il cancro. PPP2R1B è quindi spesso studiato per il suo ruolo nel mantenere l’omeostasi del fosfoproteoma e il cross-talk tra vie di segnalazione nelle cellule umane.

PP2A-Aβ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPP2R1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PP2A-Aβ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPP2R1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPP2R1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PP2A-Aβ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPP2R1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PP2A-Aβ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PP2A-Aβ nelle cellule tumorali con espressione di PPP2R1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.