POU3F4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404989-ACT

POU3F4 codifica un fattore di trascrizione con dominio POU che regola programmi di espressione genica specifici per tipo cellulare durante lo sviluppo embrionale, con ruoli rilevanti nella patterning del neuroectoderma e nella morfogenesi dell’orecchio interno. Legandosi a motivi octamerici e cooperando con cofattori, POU3F4 contribuisce a coordinare reti trascrizionali che modellano la differenziazione neuronale e l’organizzazione dell’epitelio sensoriale. L’alterazione o la disregolazione di POU3F4 è associata a forme ereditarie di deficit uditivo e a malformazioni congenite dell’orecchio interno, rendendolo un nodo utile per lo studio della regolazione genica nello sviluppo. Nei modelli cellulari, la modulazione dell’espressione di POU3F4 permette di indagare la specificazione di linea, il controllo trascrizionale dipendente dalla cromatina e i circuiti dei bersagli a valle rilevanti per fenotipi uditivi e neurali.

POU3F4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di POU3F4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

POU3F4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus POU3F4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione POU3F4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di POU3F4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus POU3F4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da POU3F4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via POU3F4 nelle cellule tumorali con espressione di POU3F4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.