Pontin 52 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402304-ACT

Il gene umano **RUVBL1** codifica **Pontin 52**, un’ATPasi **AAA+** che opera in assemblaggi multiproteici regolando l’architettura della cromatina, il controllo trascrizionale e la biogenesi di complessi macromolecolari. Pontin 52 è un componente centrale del complesso co-chaperone **R2TP** e sostiene la maturazione, dipendente da **HSP90**, di diversi complessi client, collegandosi così a processi quali le risposte al danno del DNA, il rimodellamento della cromatina e l’assemblaggio di ribonucleoproteine. Attraverso interazioni con regolatori della trascrizione e fattori di rimodellamento, **RUVBL1** influenza la progressione del ciclo cellulare e programmi di espressione genica adattativi allo stress. Un’attività deregolata di RUVBL1/Pontin 52 e un’espressione alterata sono state associate a segnali proliferativi e a difetti nel mantenimento del genoma, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici in vie rilevanti per il cancro e nelle reti di proteostasi.

Pontin 52 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RUVBL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pontin 52 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RUVBL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RUVBL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pontin 52. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RUVBL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pontin 52 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pontin 52 nelle cellule tumorali con espressione di RUVBL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.