PON1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402701-ACT

La PON1 umana (paraoxonasi 1) è un’esterasi/lactonasi calcio-dipendente prevalentemente associata alle HDL nel plasma, dove contribuisce alla detossificazione degli organofosfati e all’idrolisi dei lipidi ossidati. Limitando i prodotti della perossidazione lipidica e modificando lattòni bioattivi, la PON1 si colloca all’intersezione tra le risposte allo stress ossidativo, il rimodellamento delle lipoproteine e la segnalazione infiammatoria legata all’omeostasi vascolare. Le variazioni dell’espressione e dell’attività enzimatica della PON1 sono state associate al rischio cardiometabolico, ai processi aterosclerotici e alla suscettibilità all’esposizione a xenobiotici, e vengono spesso studiate insieme ad altre vie antiossidanti e di gestione dei lipidi. Queste proprietà rendono la PON1 un bersaglio utile per studi meccanicistici sulla funzione delle HDL, sulla biologia redox e sulle interazioni gene–ambiente in modelli cellulari umani.

PON1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PON1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PON1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PON1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PON1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PON1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PON1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PON1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PON1 nelle cellule tumorali con espressione di PON1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.