Polycystin-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400669-ACT

PKD2 codifica la policistina-2, un canale cationico non selettivo permeabile al Ca2+ che si localizza nelle ciglia primarie, nel reticolo endoplasmatico e nella membrana plasmatica, dove contribuisce a regolare la segnalazione meccanosensoriale del calcio. La policistina-2 interagisce con la policistina-1 e contribuisce al controllo dell’omeostasi intracellulare del Ca2+, della polarità cellulare e della morfogenesi dei tubuli epiteliali, integrando segnali che influenzano i programmi di proliferazione e differenziamento. La segnalazione dipendente da PKD2 interseca risposte associate a cAMP e MAPK e modula la segnalazione dipendente dal flusso di liquido negli epiteli renali. L’alterazione genetica o la disregolazione di PKD2 è fortemente associata alla malattia del rene policistico autosomica dominante e a fenotipi cistici correlati, rendendolo un bersaglio chiave per lo studio dei meccanismi delle ciliopatie.

Polycystin-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PKD2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Polycystin-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PKD2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PKD2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Polycystin-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PKD2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Polycystin-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Polycystin-2 nelle cellule tumorali con espressione di PKD2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.