PMS2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401600-ACT

PMS2 codifica un componente fondamentale del macchinario di riparazione degli appaiamenti errati del DNA (MMR), che forma l’eterodimero MutLα con MLH1 per rilevare e correggere i mismatch base–base e i loop di inserzione/delezione che insorgono durante la replicazione del DNA. Attraverso il coordinamento ATP-dipendente dell’attività endonucleasica, dell’escissione e della risintesi, PMS2 contribuisce a preservare la stabilità del genoma e a limitare il carico mutazionale nelle popolazioni cellulari in proliferazione. Alterazioni o riduzioni dell’attività di PMS2 sono associate a fenotipi di instabilità dei microsatelliti e vengono spesso studiate nel contesto delle sindromi ereditarie di predisposizione al cancro e dell’evoluzione tumorale guidata da difetti nella riparazione del DNA. Di conseguenza, PMS2 è ampiamente utilizzato per indagare la fedeltà della replicazione, il crosstalk con la risposta al danno al DNA e i meccanismi che modellano gli spettri mutazionali.

PMS2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PMS2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PMS2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PMS2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PMS2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PMS2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PMS2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PMS2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PMS2 nelle cellule tumorali con espressione di PMS2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.