PMS1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418473-ACT

Il gene umano **PMS1** codifica un omologo di MutL che partecipa alla riparazione dei mismatch del DNA, supportando la fedeltà della replicazione coordinando il riconoscimento e l’elaborazione dei mismatch base–base e dei loop di inserzione–delezione. PMS1 agisce all’interno della rete di complessi MutL per collegare il riconoscimento del mismatch alle fasi successive di escissione e risintesi, contribuendo alla stabilità del genoma e alla soppressione della mutagenesi spontanea. Difetti o un’alterata regolazione dei geni della riparazione dei mismatch possono aumentare l’instabilità dei microsatelliti e favorire l’accumulo di mutazioni, processi ampiamente rilevanti per la cancerogenesi e per le risposte cellulari allo stress. PMS1 viene quindi studiato nei percorsi che regolano la segnalazione del danno al DNA, la riparazione associata alla replicazione e il mantenimento dell’integrità cromosomica.

PMS1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PMS1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PMS1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PMS1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PMS1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PMS1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PMS1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PMS1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PMS1 nelle cellule tumorali con espressione di PMS1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.