PMCA2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403416-ACT

ATP2B2 codifica l’isoforma PMCA2 della Ca2+-ATPasi di membrana plasmatica, una pompa di estrusione del Ca2+ ad alta affinità che mantiene bassa la concentrazione di calcio citosolico e modella i transienti di Ca2+ dipendenti dallo stimolo. Accoppiando l’idrolisi dell’ATP all’efflusso di Ca2+, PMCA2 sostiene reti di segnalazione calcio-dipendenti che regolano l’eccitabilità neuronale, la trasmissione sinaptica e i processi di trasporto epiteliale. L’attività di PMCA2 si interseca con vie regolate dalla calmodulina, con la segnalazione in microdomini di membrana e con feedback omeostatici che prevengono stress proteotossico e mitocondriale guidato dal Ca2+. Alterazioni dell’espressione o della funzione di ATP2B2/PMCA2 sono state associate a una gestione disfunzionale del calcio, implicata in fenotipi neurologici e in disfunzioni dei sistemi sensoriali, a supporto della sua rilevanza per studi meccanicistici della segnalazione del Ca2+.

PMCA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP2B2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PMCA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP2B2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP2B2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PMCA2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP2B2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PMCA2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PMCA2 nelle cellule tumorali con espressione di ATP2B2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.