PMCA1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402691-ACT

ATP2B1 codifica l’ATPasi Ca2+ della membrana plasmatica umana 1 (PMCA1), una pompa di efflusso del Ca2+ ad alta affinità che ripristina bassi livelli di calcio citosolico dopo eventi di segnalazione. Esportando Ca2+ nello spazio extracellulare, PMCA1 modula l’ampiezza e la durata delle vie Ca2+-dipendenti che regolano l’eccitabilità di membrana, la secrezione, la dinamica del citoscheletro e i programmi trascrizionali. L’attività di PMCA1 si integra con la regolazione dipendente dalla calmodulina e con effettori a valle come CaMK e calcineurina/NFAT per mantenere l’omeostasi del Ca2+ cellulare. Un’alterata gestione del calcio che coinvolge ATP2B1 è stata collegata, in studi genetici e funzionali, a fenotipi cardiovascolari e neurobiologici, a supporto della sua rilevanza nella ricerca meccanicistica sui processi patologici guidati dal calcio.

PMCA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP2B1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PMCA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP2B1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP2B1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PMCA1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP2B1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PMCA1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PMCA1 nelle cellule tumorali con espressione di ATP2B1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.