Plásmido CRISPR de Activación (h) PLU-1: sc-403771-ACT

KDM5B codifica PLU-1 (JARID1B), una desmetilasa de lisina de histonas que contiene un dominio Jumonji C (JmjC) y que elimina de forma preferente las marcas H3K4me3/2, remodelando así la cromatina asociada a promotores y los programas transcripcionales. Mediante interacciones con factores de transcripción específicos de linaje y complejos de remodelación de cromatina, PLU-1 contribuye a la regulación de la progresión del ciclo celular, los estados de diferenciación y el mantenimiento de la cromatina ligado a la replicación. La actividad alterada de KDM5B se ha asociado con plasticidad epigenética y reprogramación transcripcional en múltiples contextos tumorales, por lo que es un objetivo ampliamente utilizado para estudiar el control de la proliferación y la identidad celular dependiente de la cromatina. En modelos celulares humanos, la perturbación de PLU-1 ayuda a desentrañar las vías que conectan la dinámica de la metilación de histonas con las salidas de expresión génica y las transiciones fenotípicas.

PLU-1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KDM5B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PLU-1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KDM5B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KDM5B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PLU-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KDM5B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PLU-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PLU-1 en células tumorales con expresión de KDM5B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.