PLU-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403771-ACT

KDM5B kodiert PLU-1 (JARID1B), eine Histon-Lysin-Demethylase mit Jumonji-C-(JmjC)-Domäne, die bevorzugt H3K4me3/2-Markierungen entfernt und dadurch promotorassoziiertes Chromatin sowie Transkriptionsprogramme umgestaltet. Über Interaktionen mit linienspezifischen Transkriptionsfaktoren und Chromatin-Remodeling-Komplexen trägt PLU-1 zur Regulation der Zellzyklusprogression, von Differenzierungszuständen und der replikationsgekoppelten Chromatinaufrechterhaltung bei. Eine veränderte KDM5B-Aktivität wird in mehreren Tumorkontexten mit epigenetischer Plastizität und einer transkriptionellen Neuverdrahtung in Verbindung gebracht, was KDM5B zu einem häufig genutzten Ziel für die Untersuchung der chromatinabhängigen Kontrolle von Proliferation und Zellidentität macht. In humanen Zellmodellen hilft die Perturbation von PLU-1 dabei, Signalwege zu dissectieren, die die Dynamik der Histonmethylierung mit Genexpressionsausgängen und phänotypischen Übergängen verknüpfen.

PLU-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KDM5B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PLU-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KDM5B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KDM5B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PLU-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KDM5B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PLU-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PLU-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KDM5B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.