plasma kallikrein Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402237-ACT

KLKB1 codifica la callicreina plasmatica, una proteasi serinica che opera nel sistema di attivazione da contatto per regolare la coagulazione intrinseca, la fibrinolisi e la segnalazione infiammatoria. Una volta attivata, la callicreina plasmatica scinde il chininogeno ad alto peso molecolare liberando bradichinina, collegando l’attività di KLKB1 alla permeabilità vascolare, alla biologia dell’edema e a vie che modulano le citochine. Partecipa inoltre a un’attivazione reciproca con il fattore XII della coagulazione e può influenzare la segnalazione dei recettori attivati da proteasi e le cascate correlate al complemento tramite cross-talk proteolitico. Un’attività deregolata del sistema callicreina–chinina è implicata in disturbi dell’infiammazione mediata dalla bradichinina e in fenotipi simili all’angioedema, rendendo KLKB1 un bersaglio utile per studi meccanicistici dell’accoppiamento tra emostasi e infiammazione.

plasma kallikrein Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KLKB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

plasma kallikrein Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KLKB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KLKB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di plasma kallikrein. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KLKB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da plasma kallikrein nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via plasma kallikrein nelle cellule tumorali con espressione di KLKB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.