PKC nu Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403822-ACT

PRKD3 codifica la protein chinasi D3 (PKC nu), una chinasi serina/treonina che agisce a valle della segnalazione mediata da PKC dipendente dal diacilglicerolo per regolare reti di fosforilazione che controllano proliferazione, sopravvivenza, migrazione e traffico vescicolare. PKC nu partecipa all’integrazione dei segnali provenienti da GPCR e recettori tirosin-chinasici e contribuisce a risposte trascrizionali collegate a MAPK/ERK e NF-κB, con ruoli aggiuntivi nel rimodellamento del citoscheletro e nel trasporto dal Golgi alla membrana plasmatica. Un’attività alterata di PRKD3 è stata associata a una deregolazione della segnalazione dei fattori di crescita e a fenotipi invasivi in diversi contesti tumorali, rendendolo un nodo utile per indagare il riassetto delle vie oncogeniche. Nei modelli cellulari umani, la perturbazione di PRKD3 è comunemente utilizzata per studiare il controllo, guidato da chinasi, delle risposte allo stress, dei programmi di motilità e della regolazione trascrizionale.

PKC nu Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRKD3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PKC nu Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRKD3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRKD3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PKC nu. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRKD3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PKC nu nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PKC nu nelle cellule tumorali con espressione di PRKD3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.