PKC lambda/iota Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422263-ACT

Prkci codifica l’isoforma atipica della protein chinasi C PKC lambda/iota, una chinasi serina/treonina che funge da componente centrale del complesso di polarità PAR e regola la polarità apico-basale, la divisione cellulare asimmetrica e l’organizzazione delle tight junction. Nelle cellule di topo, PKC lambda/iota integra segnali a monte provenienti da piccole GTPasi e dalla segnalazione dei fosfoinositidi per coordinare la dinamica del citoscheletro, il traffico vescicolare e la migrazione direzionale. Modula la segnalazione legata a proliferazione e sopravvivenza attraverso vie che intersecano gli output trascrizionali PI3K–AKT, NF-κB e Hippo/YAP, influenzando differenziamento e architettura tissutale. La disregolazione dell’attività delle PKC atipiche è stata associata ad alterazioni dell’integrità epiteliale, a un controllo della crescita anomalo e a fenotipi legati all’infiammazione, rendendo Prkci un nodo utile per studi meccanicistici in modelli di sviluppo, rigenerazione e malattia.

PKC lambda/iota Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Prkci senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PKC lambda/iota Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Prkci nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Prkci, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PKC lambda/iota. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Prkci nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PKC lambda/iota nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PKC lambda/iota nelle cellule tumorali con espressione di Prkci silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.