PKC epsilon Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400358-ACT

PRKCE codifica la protein chinasi C epsilon (PKCε), una chinasi serina/treonina sensibile al diacilglicerolo e indipendente dal Ca2+, che collega la segnalazione mediata dai recettori a programmi di fosforilazione che controllano proliferazione, sopravvivenza, migrazione e dinamiche del citoscheletro. PKCε integra input provenienti da GPCR e recettori tirosin-chinasici per modulare le vie MAPK/ERK, PI3K–AKT, NF-κB e quelle di rimodellamento del citoscheletro, influenzando il traffico vescicolare e la polarità cellulare. Nei tessuti umani, un’espressione o un’attività alterata di PRKCE è stata associata a una trasduzione del segnale deregolata in ambito oncologico, nelle risposte cardiovascolari e di ischemia–riperfusione e nei processi neuroinfiammatori. Queste caratteristiche rendono PRKCE un nodo rilevante per lo studio della segnalazione chinasi dipendente dal contesto, del cross-talk tra vie e dei fenotipi di adattamento allo stress.

PKC epsilon Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRKCE senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PKC epsilon Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRKCE nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRKCE, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PKC epsilon. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRKCE nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PKC epsilon nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PKC epsilon nelle cellule tumorali con espressione di PRKCE silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.