PKC epsilon Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400358-ACT

PRKCE codifica a proteína quinase C épsilon (PKCε), uma quinase de serina/treonina responsiva ao diacilglicerol e independente de Ca2+, que acopla a sinalização de receptores a programas de fosforilação que controlam proliferação, sobrevivência, migração e dinâmica do citoesqueleto. A PKCε integra sinais provenientes de GPCRs e de receptores tirosina-quinase para modular as vias MAPK/ERK, PI3K–AKT, NF-κB e de remodelamento do citoesqueleto, influenciando o tráfego vesicular e a polaridade celular. Em tecidos humanos, alterações na expressão ou na atividade de PRKCE têm sido associadas a transdução de sinal desregulada na biologia do câncer, em respostas cardiovasculares e a isquemia–reperfusão, e em processos neuroinflamatórios. Essas características tornam PRKCE um nó relevante para estudar sinalização de quinases dependente do contexto, interconexões entre vias (cross-talk) e fenótipos adaptativos ao estresse.

PKC epsilon O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PRKCE sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PKC epsilon O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PRKCE em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PRKCE, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PKC epsilon. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PRKCE nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PKC epsilon no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PKC epsilon em células tumorais com expressão de PRKCE silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.