PIWIL1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418611-ACT

PIWIL1 (PIWI-like protein 1) è un membro della famiglia Argonaute arricchito nella linea germinale che si lega agli RNA interagenti con PIWI (piRNA) per guidare il silenziamento sequenza-specifico degli elementi trasponibili e regolare la stabilità degli RNA. Attraverso la biogenesi dei piRNA e le vie di repressione epigenetica, PIWIL1 contribuisce al mantenimento dell’integrità del genoma, alla regolazione della cromatina e allo sviluppo delle cellule germinali. Un’espressione deregolata di PIWIL1 è stata riportata in molteplici tipi di tumore ed è spesso oggetto di studio per i suoi ruoli in programmi di tipo staminale, nella proliferazione e in reti alterate di piccoli RNA. Di conseguenza, PIWIL1 è ampiamente utilizzato come modello per studiare la biologia della via dei piRNA, il controllo dei trasposoni e la regolazione genica mediata da RNA nelle cellule umane.

PIWIL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PIWIL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PIWIL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PIWIL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PIWIL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PIWIL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PIWIL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PIWIL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PIWIL1 nelle cellule tumorali con espressione di PIWIL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.