Pitx3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402995-ACT

PITX3 codifica il fattore di trascrizione Pitx3 con homeodominio di tipo paired-like, un regolatore nucleare che contribuisce a definire l’identità dei neuroni dopaminergici del mesencefalo e supporta la differenziazione e il mantenimento neuronale. Pitx3 agisce all’interno di reti trascrizionali dello sviluppo che interagiscono con la segnalazione Wnt/β-catenina, con programmi responsivi all’acido retinoico e con altri fattori homeobox, modellando le decisioni di linea e gli stati di maturazione. Un’alterata regolazione di PITX3 è stata collegata alla vulnerabilità del sistema dopaminergico ed è studiata nel contesto della biologia delle malattie del neurosviluppo e neurodegenerative, incluse vie rilevanti per la malattia di Parkinson. In quanto controllore trascrizionale, Pitx3 viene inoltre utilizzato per indagare i circuiti di regolazione genica, le transizioni dello stato della cromatina e la riprogrammazione del destino cellulare in modelli cellulari umani.

Pitx3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PITX3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pitx3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PITX3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PITX3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pitx3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PITX3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pitx3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pitx3 nelle cellule tumorali con espressione di PITX3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.