PiT1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422988-ACT

Slc20a1 codifica PiT1 (SLC20A1), un trasportatore sodio-dipendente di fosfato inorganico che sostiene l’assorbimento di fosfato necessario per la sintesi dei nucleotidi, il metabolismo dei fosfolipidi e l’omeostasi energetica. Oltre alla funzione di trasporto, PiT1 contribuisce a reti di segnalazione che collegano la disponibilità di fosfato alla proliferazione, sopravvivenza e differenziamento cellulari, con collegamenti alle vie MAPK e ad altri pathway associati alla crescita. Nei modelli murini, l’attività di Slc20a1 viene spesso studiata in contesti in cui la gestione del fosfato influenza programmi di calcificazione osteogenica e vascolare, nonché processi di sviluppo e di rimodellamento tissutale. Un trasporto del fosfato deregolato e la segnalazione a valle risultano quindi pertinenti per studi meccanicistici sulla mineralizzazione, sulle risposte allo stress metabolico e sui fenotipi proliferativi.

PiT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Slc20a1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PiT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Slc20a1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Slc20a1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PiT1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Slc20a1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PiT1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PiT1 nelle cellule tumorali con espressione di Slc20a1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.