Pinin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405373-ACT

Il gene umano **PNN** codifica la pinina, una proteina nucleare e associata ai desmosomi che collega l’adesione cellula–cellula nelle cellule epiteliali con programmi di trascrizione e di processamento dell’RNA. La pinina partecipa allo splicing dell’mRNA e a processi correlati al complesso di giunzione degli esoni (exon junction complex), influenzando gli esiti dello splicing alternativo e le reti di espressione genica che determinano la differenziazione epiteliale e l’integrità dei tessuti. Attraverso i suoi ruoli nell’organizzazione dei desmosomi, negli speckle nucleari e nella regolazione della maturazione dei trascritti, PNN può modulare vie coinvolte nella polarità cellulare, nella migrazione e nella regolazione genica in risposta allo stress. Alterazioni dell’espressione o della localizzazione di PNN sono state associate a cambiamenti del fenotipo epiteliale e sono state studiate nel contesto della progressione tumorale, di programmi trascrizionali legati alla metastasi e di altri disturbi caratterizzati da deregolazione dell’adesione e dello splicing.

Pinin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PNN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pinin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PNN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PNN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pinin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PNN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pinin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pinin nelle cellule tumorali con espressione di PNN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.