PIF1 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-403130-ACT

ヒトPIF1は、G-quadruplex構造を解消し、異常なDNA中間体を巻き戻し、複製–転写コンフリクトを抑制することでゲノム安定性の維持に寄与する、5′→3′方向性のDNAヘリカーゼをコードする。PIF1は複製フォークの停滞部位で機能し、DNA複製の再開、岡崎フラグメントの処理、不適切な組換えの抑制に関与することから、中核的なDNA損傷応答および複製ストレス経路と結び付いている。さらに、テロメア代謝やミトコンドリアDNAの維持における役割を通じて、PIF1活性の変化はテロメアの完全性やミトコンドリアゲノムの安定性に影響し得る。これらの過程の破綻は、多様ながんやその他の複製ストレス関連疾患で観察されるゲノム不安定性表現型の機構研究において重要である。

PIF1 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性PIF1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

PIF1 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における PIF1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPIF1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性PIF1の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPIF1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるPIF1依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPIF1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるPIF1経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。