PIEZO1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410555-ACT

PIEZO1 codifica un grande canale cationico meccanosensibile che converte la tensione di membrana e lo stress di taglio in un ingresso di calcio, permettendo alle cellule di tradurre segnali meccanici in segnali biochimici. Regola processi fondamentali, tra cui il tono e il rimodellamento vascolare, il controllo del volume degli eritrociti, la meccanotrasduzione epiteliale ed endoteliale e l’attivazione delle cellule immunitarie, con effetti a valle su vie dipendenti dal calcio quali la segnalazione della calmodulina, il rimodellamento del citoscheletro e i programmi trascrizionali associati a YAP/TAZ. Un’attività alterata di PIEZO1 è collegata a disturbi dell’idratazione e della morfologia dei globuli rossi e a una meccanotrasduzione deregolata nella biologia cardiovascolare e linfatica. Queste proprietà rendono PIEZO1 un bersaglio chiave per studiare come le forze meccaniche influenzino le decisioni sul destino cellulare, la funzione di barriera e l’omeostasi tissutale.

PIEZO1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PIEZO1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PIEZO1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PIEZO1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PIEZO1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PIEZO1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PIEZO1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PIEZO1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PIEZO1 nelle cellule tumorali con espressione di PIEZO1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.