PIDD Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403439-ACT

PIDD1 codifica la proteina del dominio di morte indotta da p53 (PIDD), un adattatore citosolico che integra segnali di stress genotossico e cellulare all’interno di reti di segnalazione apoptotiche e infiammatorie. PIDD partecipa all’assemblaggio di complessi multiproteici come il PIDDosoma, influenzando l’attivazione della caspasi-2, le risposte al danno al DNA e le decisioni sul destino cellulare, inclusi l’apoptosi e il controllo dei checkpoint del ciclo cellulare. Attraverso interazioni proteiche mediate dal suo dominio di morte, PIDD può modulare vie correlate a NF-κB e programmi trascrizionali responsivi allo stress. La disregolazione della segnalazione PIDD1/PIDD è stata studiata nel contesto di una sensibilità alterata all’apoptosi e di fenotipi di instabilità del genoma rilevanti per la biologia del cancro e per altri disturbi della segnalazione dello stress.

PIDD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PIDD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PIDD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PIDD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PIDD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PIDD. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PIDD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PIDD nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PIDD nelle cellule tumorali con espressione di PIDD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.