PGDH Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402622-ACT

L’HPGD umano codifica la 15-idrossiprostaglandina deidrogenasi (PGDH), l’enzima limitante la velocità responsabile dell’ossidazione e inattivazione NAD+-dipendente di prostaglandine bioattive come la PGE2. Controllando il turnover dei prostanoidi, la PGDH modula gli output di segnalazione delle prostaglandine/COX che influenzano l’infiammazione, l’omeostasi epiteliale, gli stimoli angiogenici e il rimodellamento tissutale. Un’alterata attività di HPGD sposta l’equilibrio locale degli eicosanoidi ed è frequentemente studiata in contesti in cui un metabolismo delle prostaglandine deregolato contribuisce a segnali immunitari aberranti e a fenotipi proliferativi. In quanto “guardiano” del catabolismo delle prostaglandine, HPGD rappresenta un nodo utile per analizzare l’interazione tra mediatori infiammatori, stato metabolico e programmi trascrizionali.

PGDH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HPGD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PGDH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HPGD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HPGD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PGDH. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HPGD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PGDH nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PGDH nelle cellule tumorali con espressione di HPGD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.