PGAM5 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-428371-ACT

Il gene murino Pgam5 codifica PGAM5, una fosfatasi Ser/Thr localizzata sulla membrana esterna del mitocondrio che integra lo stato metabolico con la segnalazione di stress e il controllo di qualità mitocondriale. PGAM5 partecipa alla dinamica mitocondriale regolando il macchinario di fissione e interagisce con le vie della mitofagia, contribuendo a determinare gli esiti dello stress ossidativo e della depolarizzazione di membrana. È stata associata alla morte cellulare programmata e a cascate di segnalazione infiammatoria, inclusa la modulazione di ASK1/JNK e di reti MAPK attivate dallo stress correlate. La disregolazione delle vie associate a PGAM5 è rilevante in modelli di neurodegenerazione, danno da ischemia-riperfusione e lesioni tissutali mediate dal sistema immunitario, rendendola un nodo utile per studi meccanicistici delle risposte mitocondriali allo stress.

PGAM5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pgam5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PGAM5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pgam5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pgam5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PGAM5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pgam5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PGAM5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PGAM5 nelle cellule tumorali con espressione di Pgam5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.