Pez Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402896-ACT

PTPN14 codifica la protein tirosina fosfatasi non recettoriale di tipo 14 (Pez), una fosfatasi citoplasmatica che integra segnali che controllano l’adesione cellulare, la polarità e la crescita dipendente dal contatto. Pez partecipa a vie di segnalazione che convergono sulla regolazione trascrizionale Hippo–YAP/TAZ e coordina il rimodellamento del citoscheletro di actina tramite interazioni nelle giunzioni cellula‑cellula e nei complessi di adesione focale. Modulando reti di segnalazione dipendenti dalla fosforilazione, PTPN14 influenza l’organizzazione epiteliale, la migrazione e la meccanotrasduzione. Alterazioni dell’attività o dell’espressione di PTPN14 sono state associate a proliferazione deregolata e a fenotipi invasivi in diversi contesti legati al cancro, rendendolo rilevante per studi sulla segnalazione dei soppressori tumorali e sull’omeostasi delle giunzioni.

Pez Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PTPN14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pez Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PTPN14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PTPN14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pez. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PTPN14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pez nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pez nelle cellule tumorali con espressione di PTPN14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.