Pericentrin 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401822-ACT

PCNT codifica la pericentrina 2, un’impalcatura centrale del materiale pericentriolare essenziale per la maturazione del centrosoma e la nucleazione dei microtubuli. Organizzando i complessi ad anello della γ-tubulina e ancorando proteine regolatorie come AURKA e PLK1, la pericentrina 2 sostiene l’assemblaggio del fuso mitotico, la segregazione dei cromosomi e la ciliogenesi. L’alterazione dell’architettura centrosomale dipendente da PCNT compromette il controllo del ciclo cellulare e la stabilità genomica, processi spesso implicati nei disturbi dello sviluppo e nell’aneuploidia associata al cancro. Poiché l’integrità del centrosoma influenza gli output di segnalazione del ciglio primario, PCNT è rilevante anche per gli studi sulle vie di segnalazione legate alle ciglia e sulla polarità cellulare.

Pericentrin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PCNT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pericentrin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PCNT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PCNT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pericentrin 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PCNT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pericentrin 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pericentrin 2 nelle cellule tumorali con espressione di PCNT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.