PEPT1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401259-ACT

SLC15A1 codifica per il trasportatore di oligopeptidi accoppiato ai protoni PEPT1, uno dei principali sistemi di assorbimento sulla membrana apicale nelle cellule epiteliali intestinali, che importa di- e tripeptidi e numerosi substrati peptidomimetici. PEPT1 accoppia il trasporto del substrato al gradiente transmembrana di H+, collegando l’assorbimento dei nutrienti all’omeostasi del pH cellulare e all’integrazione metabolica della disponibilità di amminoacidi. In virtù del suo ruolo nella fisiologia della barriera epiteliale e nei processi di sensing dei nutrienti, l’alterazione dell’espressione di PEPT1 è stata studiata nell’infiammazione gastrointestinale e in fenotipi di trasporto intestinale deregolati. In vitro, PEPT1 è spesso utilizzato per modellare i meccanismi di assorbimento epiteliale, la regolazione dei trasportatori da parte di segnali infiammatori e la competizione tra substrati in sistemi rilevanti per l’intestino.

PEPT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC15A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PEPT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC15A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC15A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PEPT1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC15A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PEPT1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PEPT1 nelle cellule tumorali con espressione di SLC15A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.