PEPCK-C/PCK1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401295-ACT

Il gene umano **PCK1** codifica la fosfoenolpiruvato carbossichinasi citosolica (PEPCK-C), un enzima limitante della velocità della gluconeogenesi che catalizza la conversione dell’ossalacetato in fosfoenolpiruvato utilizzando GTP. La PEPCK-C integra la produzione di glucosio a livello epatico e renale con il metabolismo centrale del carbonio, collegando gli intermedi del ciclo TCA ai flussi glicolitici e anaplerotici. La sua espressione è regolata in modo stringente da segnali ormonali e nutrizionali tramite reti trascrizionali che coinvolgono la via di segnalazione cAMP/PKA, i percorsi di risposta ai glucocorticoidi e la repressione dipendente dall’insulina. L’attività deregolata di PCK1 e il controllo trascrizionale alterato sono ampiamente studiati nel contesto delle malattie metaboliche, inclusi resistenza all’insulina, biologia del fegato grasso e riprogrammazione metabolica tumorale.

PEPCK-C/PCK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PCK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PEPCK-C/PCK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PCK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PCK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PEPCK-C/PCK1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PCK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PEPCK-C/PCK1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PEPCK-C/PCK1 nelle cellule tumorali con espressione di PCK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.