PDK4 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424220-ACT

Il gene murino **Pdk4** codifica la piruvato deidrogenasi chinasi 4 (PDK4), un enzima mitocondriale che fosforila e inibisce il complesso della piruvato deidrogenasi, riducendo l’ingresso del piruvato nel ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA) e spostando il flusso di carbonio verso l’ossidazione degli acidi grassi. Modulando il passaggio tra l’utilizzo di glucosio e lipidi come substrati, PDK4 integra il rilevamento dei nutrienti con programmi metabolici a valle della segnalazione insulinica, delle risposte al digiuno e della trascrizione regolata da PPAR. Un’attività alterata di Pdk4/PDK4 è spesso studiata in contesti di inflessibilità metabolica, insulino-resistenza, steatosi epatica e rimodellamento energetico cardiaco, in cui la selezione del carburante mitocondriale e la capacità ossidativa risultano compromesse. Nei modelli murini, Pdk4 viene anche utilizzato per indagare il crosstalk tra il metabolismo del muscolo scheletrico, la lipolisi del tessuto adiposo e l’omeostasi sistemica del glucosio.

PDK4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pdk4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PDK4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pdk4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pdk4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PDK4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pdk4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PDK4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PDK4 nelle cellule tumorali con espressione di Pdk4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.