PDE6β Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422166-ACT

Il gene murino **Pde6b** codifica la subunità beta della fosfodiesterasi 6 del cGMP (PDE6β), un effettore centrale della cascata di fototrasduzione dei bastoncelli. Nei fotorecettori a bastoncello della retina, PDE6β idrolizza il cGMP a valle della segnalazione rodopsina–transducina attivata dalla luce, regolando così l’attività dei canali regolati da nucleotidi ciclici, l’iperpolarizzazione di membrana e i processi di adattamento dipendenti dal calcio. Una corretta funzione di PDE6β è essenziale per mantenere l’omeostasi dei fotorecettori e la fedeltà del segnale, collegando questo enzima agli studi sulla trasduzione sensoriale, sul metabolismo del cGMP e sulla biologia del segmento esterno. La disregolazione o la perdita dell’attività di PDE6β è ampiamente utilizzata in modelli sperimentali di degenerazione retinica ereditaria, consentendo analisi meccanicistiche delle risposte allo stress dei fotorecettori, del rimodellamento sinaptico e dei fenotipi legati alla visione.

PDE6β Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pde6b senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PDE6β Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pde6b nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pde6b, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PDE6β. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pde6b nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PDE6β nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PDE6β nelle cellule tumorali con espressione di Pde6b silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.