Pdcd-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403008-ACT

PDCD1 codifica la proteina 1 della morte cellulare programmata (PD‑1; Pdcd‑1), un recettore inibitorio espresso principalmente sulle cellule T attivate e su altri sottogruppi immunitari, che limita la segnalazione del recettore per l’antigene per mantenere la tolleranza periferica. In seguito al legame con i suoi ligandi, PD‑1 recluta fosfatasi che attenuano la segnalazione prossimale del TCR, riducendo l’attività delle vie PI3K–AKT e RAS–MAPK e modulando la produzione di citochine, la proliferazione e i programmi di sopravvivenza. Questo asse di checkpoint è centrale per l’omeostasi immunitaria ed è spesso coinvolto in condizioni di esposizione cronica all’antigene, in cui una persistente espressione di PDCD1 è associata a disfunzione delle cellule T e ad alterazioni del set point infiammatorio. La regolazione di PDCD1 è pertanto ampiamente studiata in ambiti quali l’immunologia dei tumori, i modelli di infezioni persistenti, l’autoimmunità e la riprogrammazione trascrizionale correlata alla risposta immunitaria.

Pdcd-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PDCD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pdcd-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PDCD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PDCD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pdcd-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PDCD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pdcd-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pdcd-1 nelle cellule tumorali con espressione di PDCD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.