PCMT1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418153-ACT

La protein-L-isoaspartato (D-aspartato) O-metiltransferasi 1 (PCMT1) è una metiltransferasi di riparazione proteica conservata che riconosce i residui isoaspartilici formati per deamidazione spontanea o isomerizzazione e catalizza la metilazione per facilitare il ripiegamento e il turnover delle proteine. Limitando l’accumulo di proteine danneggiate, PCMT1 sostiene le reti di proteostasi che si intersecano con le risposte cellulari allo stress, il controllo della qualità proteica associato all’invecchiamento e la regolazione della stabilità proteica. L’attività di PCMT1 è stata collegata all’omeostasi neuronale e metabolica, in cui una capacità di riparazione compromessa può contribuire all’accumulo di proteine disfunzionali e alla vulnerabilità cellulare in condizioni di stress. La disregolazione delle vie di riparazione proteica che coinvolgono PCMT1 è quindi rilevante per gli studi sulla neurodegenerazione, sulla biologia dello stress ossidativo e sui meccanismi più ampi di danno proteico nelle cellule umane.

PCMT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PCMT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PCMT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PCMT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PCMT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PCMT1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PCMT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PCMT1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PCMT1 nelle cellule tumorali con espressione di PCMT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.