PCDH8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405324-ACT

PCDH8 (protocaderina 8) è una molecola di adesione cellula-cellula calcio-dipendente della superfamiglia delle caderine che contribuisce all’architettura tissutale e alla segnalazione intercellulare nelle cellule umane. Modulando la dinamica dell’adesione e la comunicazione dipendente dal contatto, PCDH8 influenza processi quali polarità cellulare, migrazione e differenziamento, con effetti a valle sull’organizzazione del citoscheletro e sul rimodellamento delle giunzioni. Pattern di espressione delle protocaderine deregolati sono stati associati ad adesione alterata e fenotipi invasivi nella biologia del cancro, e PCDH8 viene spesso studiata nel contesto della regolazione epigenetica e del controllo trascrizionale. Come parte di reti più ampie di caderine/protocaderine, PCDH8 rappresenta un nodo accessibile per analizzare i meccanismi che collegano l’adesione di superficie a programmi di regolazione genica.

PCDH8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PCDH8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PCDH8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PCDH8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PCDH8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PCDH8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PCDH8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PCDH8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PCDH8 nelle cellule tumorali con espressione di PCDH8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.