PCCA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404791-ACT

PCCA codifica la subunità alfa della propionil‑CoA carbossilasi, un enzima mitocondriale biotina‑dipendente che catalizza la conversione, dipendente da ATP, del propionil‑CoA in D‑metilmalonil‑CoA. Questa reazione è essenziale per il catabolismo degli aminoacidi a catena ramificata, degli acidi grassi a numero dispari e delle catene laterali del colesterolo, collegando l’utilizzo di aminoacidi e lipidi all’anaplerosi mitocondriale e al metabolismo energetico. La funzione di PCCA interseca il metabolismo della biotina, l’omeostasi proteica mitocondriale e le risposte allo stress metabolico che influenzano l’equilibrio redox e la gestione degli acidi organici. L’alterazione patogena dell’attività di PCCA è associata all’acidemia propionica, rendendolo un bersaglio utile per studiare la disfunzione metabolica, la segnalazione di stress mitocondriale e le relazioni genotipo–fenotipo in modelli cellulari umani.

PCCA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PCCA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PCCA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PCCA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PCCA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PCCA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PCCA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PCCA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PCCA nelle cellule tumorali con espressione di PCCA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.