PBEF Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416248-ACT

NAMPT, também conhecido como PBEF, codifica a nicotinamida fosforribosiltransferase, a enzima limitante da via de salvamento de NAD que converte nicotinamida em mononucleótido de nicotinamida. Ao controlar a disponibilidade intracelular de NAD, o PBEF influencia a homeostase redox e sustenta enzimas dependentes de NAD, incluindo sirtuínas e PARPs, ligando o estado metabólico à regulação da cromatina, à reparação do DNA e às respostas ao stress. A atividade de NAMPT cruza-se com a função mitocondrial, a sinalização inflamatória e o controlo do ciclo celular, e a sua desregulação tem sido associada a alterações no imunometabolismo e na biologia tumoral. Como um nó multifuncional no metabolismo do NAD, o NAMPT é frequentemente estudado em contextos de adaptação metabólica, stress oxidativo e fenótipos celulares relacionados com a inflamação.

PBEF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NAMPT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PBEF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NAMPT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NAMPT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PBEF. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NAMPT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PBEF no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PBEF em células tumorais com expressão de NAMPT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.