Pax-7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400662-ACT

PAX7 codifica il fattore di trascrizione a paired box Pax-7, un regolatore chiave della specificazione della linea miogenica e del mantenimento delle cellule staminali del muscolo scheletrico. Pax-7 coordina programmi trascrizionali che controllano proliferazione, autorinnovamento e differenziamento, agendo in concertazione con i fattori regolatori miogenici per governare la rigenerazione muscolare e la definizione dei pattern durante lo sviluppo. Oltre ai ruoli nel sistema nervoso centrale e nelle linee cellulari derivate dalla cresta neurale, un’attività deregolata di PAX7 è stata collegata a un’alterata identità cellulare e a stati trascrizionali oncogeni, incluso il rabdomiosarcoma guidato da fusioni. In quanto determinante di linea, Pax-7 è ampiamente utilizzato come marcatore e nodo funzionale per studiare le decisioni di destino cellulare, la regolazione della cromatina e le reti geniche dello sviluppo nelle cellule umane.

Pax-7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PAX7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pax-7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PAX7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PAX7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pax-7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PAX7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pax-7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pax-7 nelle cellule tumorali con espressione di PAX7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.