Pax-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401657-ACT

PAX3 codifica il fattore di trascrizione a paired box Pax-3, un regolatore chiave della patterning embrionale che coordina la specificazione della cresta neurale, la miogenesi e l’impegno di linea dei melanociti. Pax-3 controlla programmi di espressione genica che governano il mantenimento dei progenitori, la migrazione e la differenziazione, integrandosi con reti di segnalazione dello sviluppo, incluse le vie WNT, BMP e FGF. Nella biologia umana, un’alterata regolazione di PAX3 è associata a fenotipi legati alla pigmentazione e allo sviluppo cranio-facciale ed è spesso studiata in contesti di plasticità di linea. Un’attività di PAX3 deregolata è rilevante anche per circuiti trascrizionali oncogenici, inclusi meccanismi guidati da fusioni e stati aberranti di tipo staminale in modelli di ricerca su sarcoma e melanoma.

Pax-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PAX3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pax-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PAX3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PAX3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pax-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PAX3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pax-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pax-3 nelle cellule tumorali con espressione di PAX3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.