PARL Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403965-ACT

PARL (presenilin associated rhomboid like) codifica una proteasi serinica romboide della membrana interna mitocondriale che regola il controllo di qualità dei mitocondri tramite la processazione di substrati coinvolti nella mitofagia, nel rimodellamento delle creste e nell’apoptosi. La proteolisi dipendente da PARL influenza la segnalazione PINK1/Parkin attraverso il clivaggio di PINK1, modulando così le risposte alla depolarizzazione mitocondriale e il turnover dell’organello. Modellando la dinamica mitocondriale legata a OPA1 e la suscettibilità apoptotica associata al citocromo c, PARL collega l’omeostasi bioenergetica alle vie di segnalazione dello stress. Un’attività di PARL deregolata e un’alterata proteostasi mitocondriale sono state implicate nella neurodegenerazione, nella disfunzione metabolica e nella riprogrammazione mitocondriale rilevante per il cancro, supportandone l’uso come nodo funzionale nella ricerca sulle vie mitocondriali.

PARL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PARL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PARL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PARL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PARL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PARL. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PARL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PARL nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PARL nelle cellule tumorali con espressione di PARL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.