PARD3B Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-406097-ACT-2

Il gene umano PARD3B codifica la proteina partitioning defective 3 homolog B, una proteina di impalcatura della polarità che si localizza alle giunzioni cellula–cellula e coordina l’assemblaggio dei complessi di polarità apico-basale con partner quali la PKC atipica e altre proteine PAR; attraverso interazioni mediate da domini PDZ, PARD3B contribuisce a regolare l’organizzazione delle tight junctions, la morfogenesi epiteliale e la migrazione direzionale integrando segnali provenienti dal citoscheletro e da vie di segnalazione delle piccole GTPasi; un’alterata funzione della rete di polarità e dell’integrità giunzionale che coinvolge PARD3B è stata implicata in processi rilevanti per la progressione tumorale, l’invasione e la disfunzione della barriera epiteliale; l’editing genetico di PARD3B consente studi meccanicistici della segnalazione dipendente dalla polarità, della dinamica delle giunzioni e delle transizioni di stato cellulare in modelli cellulari umani tramite knockout, knock-in o perturbazioni specifiche di dominio.

PARD3B Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PARD3B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PARD3B Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PARD3B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PARD3B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PARD3B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PARD3B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PARD3B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PARD3B nelle cellule tumorali con espressione di PARD3B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.